Micropropagazione Mirtillo

[dna86]

Buongiorno a tutti,
vorrei micropropagare delle piante mirtillo, non conosco bene la tecnica e chiedo a qualcuno di voi se può darmi delle delucidazioni in particolare su:
- linee generali da seguire
- tipo di substrato da utilizzare (è acquistabile in giro??)
- che parti della piante devo prendere?
Premetto che io ho a disposizione dove lavoro una cappa a flusso laminare, un autoclave e dell'agar.
Grazie mille a tutti coloro che risponderanno ai miei quesiti.

 

[Boostpolo]

ti consiglio vivamente di lasciar perdere a meno che tu non sia un tecnico di laboratorio...devi avere materialie strumenti necessari oltre appunto un ambiente di lavoro perfetto come il laboratorio.Ti dico solo che il terreno di coltura è costituito da ormoni,zucchero e acidi vari...per non parlare die mezzi necessari...Ciao

 

[dna86]

Per ciò che riguarda il laboratorio non ho problemi, volevo solo sapere se tecnicamnete era così difficile?
Grazie

 

[Boostpolo]

per quanto posso saperne io,la crescita risulta facile e veloce... apatto che tutto sia letteralmente perfetto!
il vero problema è preparare il terreno di coltura con appunto determinate sostanze quali ormoni acidi e zucchero,e poi dei particolari strumenti per sterilizzare,in oltre ogni pianta non ha le stesse esigenze,alcune vogliono altri elelmenti per crescere.L'ambiente deve essere sterile in toto e privo di ogni batterio,senza contare che l'insorgere di malattie,in quelle condizioni è praticamente impossibile da controllare vista temepratura e umidità...

 

[dna86]

Non c'è nessuno che sà darmi qualche dritta più specifica? Grazie

 

[cactucolo]

Se hai un laboratorio e un infarinatura di biologia delle piante e coltura cellulare è semplicissimo, cerca un po' in rete per le more ho questo protocollo che può fungere da punto di partenza, http://www.ufpel.tche.br/faem/agrociencia/v2n1/artigo03.pdf

PS: ecco qui un protocollo per mirtillo http://www.banglajol.info/index.php/PTCB/article/view/3650/3016
Ciao

 

[dna86]

Grazie mille, leggendo un po' il protoccollo ho messo giù questi appunti:
a. Prelievo di frammenti di rami non significati di 3 – 5 cm
b. disinfezione rami in acqua corrente, poi in una soluzione con un detergente liquidi per 2 minuti, sterilizzazione con una soluzione 0.1% Tween 20 (poliossietilene sorbitano monolaurato) per 2-8 min, e poi lavati tre volte in acqua deionizzata sterile,
c. poi le sezioni sono state tagliate in 1 - 2 cm, lasciando un singolo nodo con le foglie
d. messa delle porzioni nel terreno base WPM (Woody Plant Mezzo), composto da:
• saccarosio (25 g/l),
• agar (6 g/l),
• IBA (10 micron/l)
• 2-ip (15 mg/l)
e. Il pH è stato aggiustato a 5,2 prima in autoclave a 121 º C per 20 min
f. le culture di tutti gli esperimenti sei espianti sono stati coltivati per 450 ml flacone di coltura, che conteneva 80 ml di terreno di coltura
g. I flaconi sono stati collocati in posizione verticale e mantenuta a 24-28 ° C sotto un fotoperiodo di 16 ore l'intensità di illuminazione di 2000 lux.
h. gli espianti sonon stati coltivati per 4 settimane + 4 settimane
i. Quando l'altezza della piantina e lunghezza della radice sono stati oltre 5 e 1 cm, le piantine radicate sono state portate via dai tubi cultura. Le radici sono state lavate per liberare il terreno di coltura. Poi le piantine sono state trapiantate in vasi con terra e sabbia nera (1, 1).
j. Dopo il trapianto le piantine sono state irrigate costantemente e poi coperte con film plastico. I vasi con le piantine trapiantate sono stati tenuti a 22 ± 2 ° C, umidità 95% a 16 ore di fotoperiodo con 2000 lux per la crescita.

Secondo voi potrebbe avere senso questo procedimento?????
Non ho però trovato bene il periodo dell'anno in cui si possono fare i prelievi, voi lo sapete???

 

[cactucolo]

Il periodo dell'anno in cui prelievi i frammenti non influisce sulla propagazione in vitro, ma è meglio farlo al risveglio vegetativo, o comunque durante il preiodo di vegetazione.
Per quanto rigurda il punto e devi sterilizzare l'acqua, preparare il terreno e quando questo è pronto aggiustare il pH (giusto per chiarezza). Non ho letto il protocollo, quindi non so dirti nello specifico
Se hai tutto a disposizione in bocca al lupo.
Ciao

 

[dna86]

con cosa aggiusto il pH?

 

[cactucolo]

Ho leggiucchiato il protocollo effettivamente dice di preparare il terreno al giusto pH e alla fine sterilizzare, riflettendoci per piccole quantità è più comodo. Se in laboratorio hai a disposizione un sistema di filtrazione e dei filtri (sterili) da 0.2 puoi sterilizzare filtrando anzichè autoclavare è molto più rapido e in genere preferibile.
Il pH lo aggiusterai con HCl o NaOH la normalità la sceglierai in base al volume da preparare secondo me 0,01 dovrebbe andare bene per i tui scopi, magari se vedi che ci vogliono troppe gocce per ottenere il pH desiderato usa 0,1 N (do per scontato che avendo a disposizione un laboratorio capisci quello che scrivo, in caso contrario chiedi pure).
Ciao

 

[dna86]

Ti capisco, sono laureato in agaria. E di micropropagazione ho sempre sentito parlare ma praticamnate non l'ho mai fatta.
Ti volevo chiedere un po' dove fosse possibile trovare alcuni prodotti com:
saccarosio, il 2-ip e l'IBA, il disinfettante Tween e l'agar ce l'ho.
Volevo poi sapere se mi convine mettere il substrato in capsule petri o dentro delle provettino, inoltre devo mettere un solo pezzetto vegetativo per provetta o capsula?
Grazie mille Cactucolo

 

[cactucolo]

Il saccarosio è il comune zucchero da cucina, l'isopentenil adenina (2-ip) e l'acido indol butirrico (IBA) li puoi trovare da un fornitore per laboratorio, tipo Sigma, Promega e altri.
Come contenitori si usano dei barattolini o vaschette tipo questi per intendersi http://www.sigmaaldrich.com/labware/labware-products.html?TablePage=9578291
http://www.sigmaaldrich.com/catalog...O|BRAND_KEY&N4=V8630|SIGMA&N25=0&QS=ON&F=SPEC
Eventualmente ottimi sono i vasetti per l'esame delle urine.
Ciao

 

[dna86]

Ciao Sergio, siti on line ne consoci che vendano il 2 ip e l'Iba?
Poi ti volevo chiedere se non mi sbaglio lo zucchero da cucina non è mica fruttosio?
Se uso delle provettine tipo quelle dell'urina, metto una pianticina per provettina no?
Grazie mille

 

[cactucolo]

Ciao
purtroppo siti on line non ne conosco, prova a fare una ricerca comunque se ci sono li trovi facilmente.
Lo zucchero da cucina è il saccarosio un disaccaride composto da glucosio+fruttosio, il fruttosio c'è ma legato al glucosio .
Meglio delle provettine sono i biccheri, questi per intenderci http://www.google.it/imgres?imgurl=...o8AOJyfCgDw&page=1&ndsp=19&ved=1t:429,r:0,s:0 puoi metterci due o tre piantine, se usi le provette una per provetta.
Ciao

PS puoi tentare di trovare qualche prodotto a base di IBA e ip-2 in un consorzio agrario

 

[dna86]

Ciao Sergio mi chiedevo una cosa:
- per la preparazione del terreno, metto tutti gli ingredienti, contemporaneamnete e poi procedo semplicemente come quando preparo l'agar?

 

[Stefy]

Ciao, sto seguendo la discussione perchè anche io ho intenzione di provare, ma con le piante ornamentali....Sergio ha dato una mano anche a me
Per l'IBA, prova da questo venditore e-bay, vende anche altre cose che magari possono esserti utili tipo la citochinina o altro , i prezzi sono migliori di quelli italiani

 

[cactucolo]

Per preparare il terreno metti prima il saccarosio lo solubilizzi tutto e poi metti gli altri ingredienti per ultimo l'agar, agiti bene per eliminare i grumi, porti ad ebollizione (dovresti usare una beuta) e poi fai raffreddare, non appena il mezzo ha raggiunto i 50°C misuri il pH e se è necessario lo porti al valore desiderato. A questo punto puoi sterilizzare. Ti conviene sterilizzare direttamente nei contenitori finali se questi non sono già sterili.
In ogni caso ti ricordo di versare il terreno sterilizzato nei contenitori sotto cappa prima che l'agar si gelifichi, per i tuoi scopi 2-3 cm di soluzione per vasetto.
Devi disinfettare anche il materiale vegetale, a questo scopo puoi usare tween20 0,2% in una soluzione 15% di candeggina, alcuni usano detergenti commerciali.

Per stefania, ma tu hai comprato dal tizio? ti sono arrivati i prodotti?

Ciao

 

[Stefy]

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Per stefania, ma tu hai comprato dal tizio? ti sono arrivati i prodotti?

Ciao

Ti tengo aggiornato, ho comprato ma devo ancora ricevere i prodotti
Senti, io ho comprato i petri dishes, pensi che vadano bene per far germogliare i frammenti vegetali che poi ripicchetterò (se la cosa riuscirà, naturalmente) in altri contenitori?

 

[dna86]

Dopo la preparazione dell'agar posso immediatamente mettere il materiale vegetale nei contenitori?
Devo successivamente cambiare il substrato per la crescita delle piantine?
Grazie mille di tutti i consigli Sergio

 

[cactucolo]

@Stefania, te lo chiedo perchè avendo provenienza extracomunitaria, potrebbe passare molto tempo e potresti dover andare a sdoganare personalmente il pacco (quando vedono qualcosa che non sanno cosa sia entrano nel panico) e avere a che fare con le autorità doganali è un'impresa.
Le capsule di petri vanno benissimo per i tuoi scopi, tu tenterai una vera e propria micropropagazione, qualla di dna è una radicazione in vitro, una tecnica più semplice che eventualmente potresti provare anche tu per impratichirti.

@dna, una volta preparato l'agar normalmente si attende il raffreddamento a 50°C a questa temperatura si misura il pH ed eventualmente si aggiusta. Poco prima dell'uso si sterilizza il terreno agarizzato (è consigliabile farlo subito dopo aver aggiustato il pH), dopo di che, sotto cappa, quando il terreno è ancora fluido si versa nei contenitori finali. Quando l'agar è quasi gelificato inserisci le mini talee. Non è necessario cambiare mezzo di coltura, i terreni agarizzati sono terreni "definitivi". Ricordati di rispettare tutte le procedure di disinfezione degli strumenti e degli ogetti che metti sotto cappa, materiale vegetale compreso.
Ciao